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Primer Prediction
使用者如果要進行 PCR 實驗，可以先使用 JEMBOSS 提供的 eprimer3 程式，幫助使用者從template 核酸序列預測出數個最適合的primer，以節省設計primer的時間，並協助實驗的進行。
ePrimer3 操作步驟
Go to : eprimer3
輸入序列：
From database：在 sequence filename 的欄位中輸入資料庫及序列名稱(或序列的 accession number)，可直接由資料庫中叫出序列 (如 embl:eclac)。
Copy/paste：將已有序列 copy/paste 輸入。
From local file：將已儲存於個人電腦中的序列檔案，利用拖曳的方式，由右方的 file manager 中拉到 sequence filename 的欄位內。
Advanced options :
如果要使用 eprimer3 的預設值來尋找primer，程式將對 template 核酸序列的全長進行分析，並找到合適的primer。倘若使用者僅需針對序列上的某一段區域進行研究，就必須由Advanced Options選項中再作設定，選出能夠amplify出該段區域的PCRprimer。
Advanced Options 中有許多選項，以下針對一些較常用的選項作個簡單的說明：
"Exlplain flag"，勾選之後，會以文字方式列出primer的統計數值，並列於結果之中。
"Create results files for each sequence"，勾選後會多出兩項結果 -- 分別為所有的forward primers ，以及所有的 reverse primers 的列表。不勾選則不會顯現這兩項結果。
"Select task" 下拉選單：包括可以從 template 序列中挑選 PCR primer，或是挑選雜交用探針 (hybridization probe)，亦或是同時挑選兩者，或只挑選 forward / reverse primers。
"Included region(s)" 設定包含primer的區域：輸入前後兩組數字，中間以逗號間隔 (如 250,800) ，表示在 template 序列上第 250-800 的位置 (約 550 bp長度範圍) 是挑選primer的區域。
"Target region(s)" 目標區域：輸入前後兩組數字，中間以逗號間隔 (如 400,450)，代表序列中的第400-450 的位置，則這一段區域最後會將被包含在 PCR 產物之中。通常在 template 序列的某一區域，存在著某一種特徵時 (如一段重複序列 repeat sequence 等) 時，為了將這一段以PCR 方法 amplify 出來，使用者才必須界定 target region。
"Excluded region(s)" 排除區域：輸入前後兩組數字，中間以逗號間隔 (如 1000,1250)，表示這一段範圍將不會列為挑選primer的區域。做這項選擇時，通常是在template 序列上的某一範圍或是序列的末端，存在著低複雜性序列或是 ALU repeat sequence 等狀況時，使用者可以將這一段區域排除在外，不考慮在該處挑選primer。
"GC clamp" 在 forward / reverse primer 的 3' 端 GC clamp 的數目：預設值為 0 個。
"Primer optimum size", "Primer minimum size", "Primer maximum size" primer長度的選項，依個人需求自行設定。
"Primer optimum Tm", "Primer minimum Tm", "Primer maximum Tm" primer之 melting temperature 選項，依使用者需求輸入合適的溫度。
"Maximum self complementarity" 單一條的primer (forward or reverse primer) 自己互補的程度：自行輸入一個分數作為判定。每一個互補的鹼基給一分，不互補 (mismatch) 扣一分，加入gap 扣兩分，預設值為 8分。
"Maximum 3' self complementarity" 一對primer在 3' 端互補的程度：若是一對primer在 3' 端產生互補，則容易形成 dimer。程式預設值為 3 分。若設為 0 分表示不允許一對primer形成 dimer，此外，這個選項的分數也不能大於 "Maximum self complementarity"。
"Maximum polynucleotide repeat" primer的序列中重複序列 (如 AAAAAA) 包含的個數。
"Product optimum size" PCR產物的長度：預設值為 200 bp，可依使用者的需求自行調整大小。若輸入 0 則表示 PCR 產物長度不受限制。
"Product size range" PCR產物的長度範圍：預設值為 100-300，但如果當 "Product optimum size" 設定為較大的長度時，此選項的數值也應隨之修正。
關於 Advanced Options 之其他選項，可以參考說明網頁，自行設定最適當之參數。
實例：
由 ECLAC gene 序列之 350~1100 bp 的區域預測可用的primer。條件為:primer長度為 20 bp 左右的長度、PCR product 長度為 300 bp、primer最適 Tm 為 60℃，且必須包含第 650~730 bp 的區域，另外在序列的 900~930 bp 的位置為低複雜性序列，必須排除。最後，再勾選 "Exlplain flag" 及 "Create results files for each sequence" 兩個選項，希望能列出比較詳盡的結果。
實例分析結果：
當勾選了 "Exlplain flag" 及 "Create results files for each sequence" 兩個選項之後，結果將有四欄，其中 xxx.rev 和 xxx.for 為全部的 forward 以及 reverse primers 的列表。而在 xxx.eprimer3 的結果裡，前半部為 Exlplain flag 的說明 (如右圖)，後半部才是預測到的一對primer (請見下圖)。若遵照預設值則只列出前 5 對最適當的primer，如果希望更多結果，使用者可再自行設定。
ORF
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